蛋白質結合于填料之后，必須再將目標蛋白質洗脫，并收集層析柱柱后的流出液。多數情況下，洗脫過程用于將不需要的蛋白質從目標蛋白質中分離或者去除。不需要的蛋白質可能與填料結合的不是那么緊密，因而會先于目標蛋白質被洗脫。另外一些情況下，不需要的蛋白質會與填料結合更加緊密，并會在目標蛋白被洗脫之后仍與填料結合。這種情況通常發生在疏水層析法（HIC）分離蛋白質多聚體時，目標蛋白多聚體與填料的結合比單體與填料的結合更加緊密。在洗脫過程中，流出液組分可能含有高純度產品，但在其之前或之后也會含有大量的不需要的蛋白質雜質。洗脫過程（梯度洗脫）如圖所示，該圖說明用HIC分離純化時，在洗脫步驟中，應將柱后流出液進行等份收集，這樣才可以獲得適宜純度的產品。